Δισεκατομμύρια άνθρωποι πάσχουν από Aνδρογενετική Aλωπεκία, γυροειδή αλωπεκία, telogen effluvium ή τριχόπτωση λόγω χημειοθεραπείας και δυστυχώς, υπάρχουν ελάχιστες αποτελεσματικές αγωγές για την αντιμετώπιση των βασικών αιτιών που προκαλούν αυτές τις διαταραχές, αλλά και τις αλλαγές στα μαλλιά λόγω της γήρανσης.
Ίσως, ο πιο αποτελεσματικός τρόπος για την αποκατάσταση των μαλλιών θα ήταν να ενεργοποιήσουμε ξανά τα τριχοθυλάκια που έχουν υποστεί σμίκρυνση ή καταστροφή, να τα εισάγουμε σε ένα νέο αναγενές στάδιο και να τα διατηρήσουμε σε φυσιολογική κυκλικότητα, παρεμβαίνοντας στα γονίδια που προκάλεσαν τη νόσο αρχικά, μέσα από τη Γενετική Μηχανική. Καθώς βελτιώνονται οι γνώσεις μας για τις διαταραχές των τριχοθυλακίων δεν είναι λίγοι αυτοί που πιστεύουν πως «γονιδιακές θεραπείες» θα μπορούν να σχεδιάζονται γι’ αυτόν το σκοπό και μέσω της στοχοποιημένης γονιδιακής επιδιόρθωσης (targeted gene repair) ιατροί και ασθενείς ελπίζουν πως θα νικήσουν τη «μάχη» ενάντια στην Ανδρογενετική Αλωπεκία.
Η Γενετική Μηχανική (γονιδιακή θεραπεία) είναι η μέθοδος με την οποία θα μπορούσαν κάποια από τα γονίδια που ελέγχουν τη φυσιολογία του τριχοθυλακίου να «χειραγωγηθούν» προκειμένου τα τριχοθυλάκια να εκφράζουν επιθυμητά χαρακτηριστικά.
Γονίδια υποψήφια για γονιδιακή παρέμβαση είναι ίσως αυτά που προάγουν την έναρξη του αναγενούς σταδίου, καθώς και τα γονίδια που παρατείνουν ή διατηρούν το τριχοθυλάκιο σε αναγενές στάδιο, ίσως κάποια ενεργοποιητικά γονίδια που μπορούν να αυξήσουν το μέγεθος του τριχοθυλακίου ή ανασταλτικά γονίδια που περιορίζουν τη μετάβαση από το αναγενές στο καταγενές στάδιο. Τέλος, σε περίπτωση πλήρους απώλειας τριχοθυλακίων, θα ήταν χρήσιμη η έναρξη σχηματισμού εντελώς νέων τριχοθυλακίων, όπως συμβαίνει κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης.
Ενώ όμως τα παραπάνω ακούγονται ενδιαφέρουσες προοπτικές, στην πραγματικότητα θα δούμε πως αποτελούν ένα… τυπικό σενάριο επιστημονικής φαντασίας, τουλάχιστον με τις παρούσες γνώσεις και δυνατότητές μας στο πεδίο της Γενετικής Μηχανικής.
Τι είναι η Γενετική Μηχανική;
Η Γενετική Μηχανική είναι η τεχνική αντικατάστασης των γονιδίων σε ενήλικα κύτταρα με σκοπό να προκληθούν αλλαγές στην κυτταρική λειτουργία. Πρόκειται για μια τεχνική στα αρχικά ακόμα στάδια ανάπτυξής της και είναι ελάχιστα τα παραδείγματα επιτυχημένης εφαρμογής της. Συγκεκριμένα, η συντριπτική πλειοψηφία (96%) των υπό διενέργεια μελετών στη γενετική μηχανική βρίσκονται ακόμα σε Phase I-II. Επειδή πολλοί είναι οι ασθενείς και οι ιατροί που ελπίζουν πως στο κοντινό μέλλον θα υπάρξει λύση για την ΑΑ από αυτόν τον κλάδο της Ιατρικής, αξίζει να διερευνηθεί η θεωρητική πιθανότητα η Γενετική Μηχανική να προσφέρει μια μελλοντική μέθοδο αντιμετώπισης της ΑΑ και των λοιπών διαταραχών των τριχοθυλακίων.
Γιατί όμως το τριχοθυλάκιο;
Το τριχοθυλάκιο αποτελεί θεωρητικά ιδανικό στόχο για τη Γενετική Μηχανική, τόσο για την αντιμετώπιση δερματικών διαταραχών όσο και για συστηματικές ασθένειες. Το τριχοθυλάκιο είναι εύκολα προσβάσιμο και αποτελεί έναν ορατό, «ασφαλή» στόχο, χωρίς να προκαλείται οποιαδήποτε βλάβη στο δέρμα με τη στόχευση και παρέμβαση σε αυτό. Η χορήγηση δραστικών ουσιών σε στοχοποιημένα σημεία μέσα στην τριχοσμηγματογόνο μονάδα προσφέρει ευκαιρίες όχι μόνο στην αντιμετώπιση ασθενειών που σχετίζονται με τα τριχοθυλάκια, αλλά και στη γενικότερη γονιδιακή θεραπεία, στην ανοσοθεραπεία και στη συστεμική χορήγηση ουσιών. Η epidermolysis bullosa, η epidermolytic hyperkeratosis, η lamellar ichthyosis και η X-linked ichthyosis είναι μονογονιδιακές, υπολειπόμενες, δερματικές ασθένειες, για τις οποίες οι νεότερες εξελίξεις δείχνουν ότι η Γενετική Μηχανική ίσως να διαδραματίσει ρόλο στη θεραπεία τους. Η στοχευμένη δερματική γονιδιακή θεραπεία μπορεί, επίσης, να χρησιμοποιηθεί για συστηματικές θεραπείες, όπως η παθητική ανοσοποίηση και ο εμβολιασμός. Οι Shi et al.και οι Fan et al. Απέδειξαν στο δέρμα ποντικιών την ανοσολογική ανταπόκριση στα προϊόντα πρωτεΐνης κωδικοποιημένα από τοπικά εφαρμοσμένο γυμνό DNA.
Οι μελέτες αυτές έδειξαν πως οι τοπικές προσεγγίσεις μπορούν να στοχεύσουν τα δενδριτικά αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα του δέρματος. Άλλες πιθανές συστηματικές εφαρμογές της δερματικής γονιδιακής θεραπείας περιλαμβάνουν τη θεραπεία της αιμοφιλίας και της ανεπάρκειας της αυξητικής ορμόνης, χρησιμοποιώντας επιδερμικά κερατινοκύτταρα ως συνθετικά, εκκριτικά κύτταρα. Όμως, η αντιμετώπιση της ΑΑ με τη Γενετική Μηχανική είναι μια εντελώς… άλλη ιστορία!
Τεχνικά ζητήματα
Η Γενετική Μηχανική είναι ένα πολύ ενδιαφέρον επιστημονικό πεδίο, τουλάχιστον σε θεωρητικό επίπεδο. Στην «εργαστηριακή» πραγματικότητα όμως εκκρεμούν ακόμη αρκετά τεχνικά ζητήματα για την επιτυχημένη γονιδιακή «θεραπεία» καταστάσεων όπως η ΑΑ και προκειμένου να μπορέσει να εφαρμοστεί αργότερα με επιτυχία και στην κλινική πράξη, θα πρέπει να ξεπεραστούν πολλά εμπόδια και να επιβεβαιωθεί η ασφάλεια της όποιας παρέμβασης.
Γενικά, η αποτελεσματική γονιδιακή θεραπεία περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια:
- Προσδιορισμός γονιδίου/γονιδίων
- Απομόνωση γονιδίου/γονιδίων
- Στοχοποίηση των βλαστοκυττάρων του οργάνου
- Μεταφορά γονιδίου/γονιδίων στα βλαστοκύτταρα
- Παράδοση γονιδίου/γονιδίων στον πυρήνα
- Ένταξη γονιδίου/γονιδίων στο DNA
- Εξασφάλιση προβλέψιμου αποτελέσματος
- Εξασφάλιση παρατεταμένης δράσης
- Εξασφάλιση μακροχρόνιας ασφάλειας.
Αναλυτικότερα, θα δούμε παρακάτω τις τεχνικές και λειτουργικές απαιτήσεις του κάθε σταδίου τόσο γενικά για τη Γενετική Μηχανική όσο και συγκεκριμένα για το τριχοθυλάκιο, όπου, φυσικά, υπάρχουν δεδομένα. Το σημαντικότερο, όμως, που πρέπει να συγκρατήσει κανείς είναι πως όλα τα παραπάνω στοιχεία είναι εξίσου σημαντικά και απαραίτητα και κανένα δεν μπορεί να παραμείνει άλυτο.
Η «εξίσωση» της γονιδιακής θεραπείας είναι ουσιαστικά ένα γινόμενο και αν οποιοσδήποτε από τους πολλαπλασιαστές απουσιάζει, δηλαδή ισούται με μηδέν, μηδενίζεται και ολόκληρο το «γινόμενο»!
Μπορεί κανείς να το παρουσιάσει σαν μια «αλυσίδα»: οποιοσδήποτε κρίκος και να λείπει, η αλυσίδα αχρηστεύεται. Τα στάδια στη Γενετική Μηχανική, ένα-προς-ένα, είναι τα εξής:
Προσδιορισμός Γονιδίων & Απομόνωση στη Γενετική Μηχανική
Αυτά τα ζητήματα εξετάζονται στην ενότητα «Αιτιολογία της Ανδρογενετικής Αλωπεκίας». Πολύ περιληπτικά, πρέπει να θυμάται κανείς πως δεν γνωρίζουμε ποια και πόσα είναι τα γονίδια που πρέπει να στοχεύσουμε προκειμένου να αντιστρέψουμε την εικόνα της Ανδρογενετικής Αλωπεκίας ή να την προλάβουμε. Γνωρίζουμε πως η ΑΑ είναι πολυγονιδιακή κατάσταση αλλά δεν γνωρίζουμε όλα ή έστω τα βασικά γονίδια που την προκαλούν.
Στοχοποίηση των κυττάρων του οργάνου
Η στοχοποίηση των κατάλληλων κυττάρων είναι κρίσιμη για την επιτυχία της γονιδιακής θεραπείας. Αν στοχευθούν ώριμα κύτταρα, ακυρώνονται τα όποια οφέλη, καθώς αυτά τα κύτταρα φθείρονται και αντικαθίστανται από νέα κύτταρα που θα φέρουν ξανά το αρχικό DNA. Προκειμένου να εξασφαλιστεί μακροχρόνιο αποτέλεσμα, είναι απαραίτητο να στοχεύονται τα βλαστοκύτταρα του εκάστοτε οργάνου. Όταν η στόχευση είναι επιτυχής, τα τροποποιημένα βλαστοκύτταρα θα δημιουργήσουν στη συνέχεια τροποποιημένα μεταβατικά ενισχυτικά κύτταρα (altered transient amplifying cells), τα οποία με τη σειρά τους θα δημιουργήσουν τροποποιημένα εξειδικευμένα κύτταρα που θα εκφράζουν πλέον μόνιμα τα επιθυμητά νέα χαρακτηριστικά. Τα τριχοθυλακιακά βλαστοκύτταρα είναι ικανά να παράγουν τα περισσότερα από τα κύτταρα που συνθέτουν την ανθρώπινη επιδερμίδα. Όμως, υπάρχουν 4 πληθυσμοί κυττάρων που έχουν ίσες πιθανότητες να αποτελούν τον ιδανικό στόχο για την εισαγωγή γονιδίων στο τριχοθυλάκιο. Επίσης, υπάρχει και η πιθανότητα να είναι κάποιος συνδυασμός στόχευσης απαραίτητος. Οι πληθυσμοί των τριχοθυλακιακών βλαστοκυττάρων βρίσκονται στις παρακάτω ανατομικές περιοχές:
- στο σμηγματογόνο αδένα
- στη χοάνη
- στην περιοχή διόγκωσης
- στη χοριακή θηλή.
Ταυτόχρονα, το τριχοθυλάκιο είναι ίσως το πλέον ενεργό μεταβολικά όργανο στο ανθρώπινο σώμα και παρουσιάζει τον ταχύτερο πολλαπλασιασμό από οποιονδήποτε άλλο ιστό. Ο συνεχής πολλαπλασιασμός και η ανάπτυξη της επιδερμίδας και του τριχοθυλακίου αποτελούν ταυτόχρονα πλεονέκτημα και μειονέκτημα για τη Γενετική Μηχανική. Οι ιοί που χρησιμοποιούνται ως κύριοι φορείς στη Γενετική Μηχανική απαιτούν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων προκειμένου να εκφραστεί το διαγονίδιο (transgene) και να ενταχθεί στο γονιδίωμα.
Όμως, τα κύτταρα στην επιδερμίδα και στο τριχοθυλάκιο που σχετίζονται με την έντονη πολλαπλασιαστική δράση (transient am- plifying cells), έχουν μικρή διάρκεια ζωής. Επίσης, δεδομένου ότι τα βλαστοκύτταρα σπάνια διαιρούνται, η στόχευση αυτών των κυττάρων αποτελεί ένα σημαντικό πρόβλημα και απαιτείται η άριστη κατανόηση της πολλαπλασιαστικής συμπεριφοράς τους. Άλλο ένα ζήτημα είναι πως επειδή τα επιδερμικά βλαστοκύτταρα είναι λίγα σε αριθμό και διαιρούνται με αργούς ρυθμούς, πρέπει να «ερεθιστούν» προκειμένου να αρχίσουν να πολλαπλασιάζονται.
Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με δερμοαπόξεση, η οποία αφαιρεί τη μεσο-τριχοθυλακιακή επιδερμίδα (interfollicular epidermis) και προκαλεί την ταχεία αναγέννηση από τα βλαστοκύτταρα, όπως έχει αποδειχθεί σε πειράματα που έγιναν σε ποντίκια.
Γενετική Μηχανική: Μεταφορά & Πολλαπλασιασμός
Η πιο συνηθισμένη μέθοδος μεταφοράς και εισαγωγής των επιθυμητών γονιδίων στα κύτταρα στόχους απαιτεί τη χρήση ιών. Οι ιοί έχουν τη μοναδική ιδιότητα να αναγνωρίζουν συγκεκριμένα κύτταρα, να τα επιμολύνουν, να εισάγουν το γενετικό υλικό τους στον πυρήνα και τελικά να το ενσωματώνουν στο γενετικό υλικό των κυττάρων αυτών (ξενιστές).
Μετά την επιμόλυνση από έναν τυπικό ιό, ο ξενιστής παράγει τις πρωτεΐνες κατ’ εντολή του DNA του ιού, προκαλώντας την έκφραση των διαφόρων ασθενειών. Οι περισσότερες υπό έρευνα μελέτες Γενετικής Μηχανικής βασίζονται σε ρετρο-ιούς (retroviruses) για την ενσωμάτωση των επιθυμητών γονιδίων στα κύτταρα, ενώ εναλλακτικοί φορείς (vectors) είναι οι αδενοïοί (adenoviruses), οι adeno-asso- ciated ιοί, οι lenti-viruses, οι pox-viruses και οι herpes viruses. Οι ιοί μπορούν να εγχέονται απευθείας στη θέση που βρίσκονται τα βλαστοκύτταρα (in vivo μέθοδος) ή τα βλαστοκύτταρα μπορούν να καλλιεργούνται, να τροποποιούνται από τους ιούς στην καλλιέργεια και στη συνέχεια να επανεισάγονται πίσω στον οργανισμό (ex vivo μέθοδος). Οι ιοί που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως φορείς γονιδίων προς τα τριχοθυλάκια θα πρέπει να μπορούν να εξασφαλίσουν:
- μεγάλη διαμολυσματική ικανότητα για διαιρούμενα και μη διαιρούμενα κύτταρα
- στόχευση στα κατάλληλα κύτταρα
- συνεχή και ρυθμιζόμενη έκφραση του διαγονιδίου
- ελάχιστη ανοσολογική αντίδραση
- μηδενικές μεταλλάξεις στο ενδογενές DNA λόγω ενσωμάτωσης
- εύκολη, επαναλήψιμη και οικονομική μαζική παραγωγή των ιών.
Στη γονιδιακή θεραπεία, αρχικά το DNA του ιού θα πρέπει να είναι εξασθενημένο, ώστε να μην μπορεί να προκαλέσει νόσο, αλλά να εξακολουθεί να είναι σε θέση να εισάγει DNA στα κύτταρα-στόχους. Τα επιθυμητά γονίδια θα πρέπει να είναι «συγκολλημένα» πάνω στο DNA του ιού και οι ιοί να εισάγουν το DNA τους αυτό στα κύτταρα-στόχους του τριχοθυλακίου.
Παράδοση γονιδίων στο τριχοθυλάκιο
Τα ανασυνδυασμένα γονίδια (recombinant genes) είναι ευμεγέθη και πολωμένα μόρια, τα οποία πρέπει να «καθοδηγηθούν» έως τον πυρήνα του κυττάρου-στόχου. Οι συμβατικές τεχνικές per os χορήγησης φαρμάκων δεν είναι κατάλληλες για χρήση στη Γενετική Μηχανική. Ο λόγος είναι πως η γαστρεντερική οδός θα «αντισταθεί» στην απορρόφηση των ανασυνδυασμένων γονιδίων, των πρωτεϊνών και άλλων σύνθετων μορίων μέχρις ότου να διασπαστούν σε μικρότερα μόρια (αμινοξέα, μονοσακχαρίτες κτλ.), τα οποία δεν θα έχουν καμία θεραπευτική αξία.
Αντίστοιχα, η ενδοφλέβια ή και υποδόρια ένεση δεν θα μπορούσε να στοχεύσει τα τριχοθυλάκια και μόνο, ενώ θα εμπεριείχε τον κίνδυνο ενσωμάτωσης των ανασυνδυασμένων γονιδίων σε άλλα όργανα, ακόμα και στα γενετικά κύτταρα (γαμέτες).
Η διαδερμική χορήγηση φαίνεται ως μια προφανής λύση για τη μεταφορά των ανασυνδυασμένων γονιδίων στο τριχοθυλάκιο. Η διαδερμική χορήγηση έχει σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των παραδοσιακών μεθόδων χορήγησης φαρμάκων, δηλαδή της per os οδού που έχει κακή μακρομοριακή βιοδιαθεσιμότητα ή των ενέσεων, που φέρουν το μειονέκτημα του πόνου της ενέσεως, της πιθανότητας ακούσιου τρυπήματος του χειριστή και των πιθανών παρενεργειών λόγω της παροδικής υψηλής συγκέντρωσης στον ορό (bolus) και της συστηματικής επιμόλυνσης.
Επιπλέον πλεονεκτήματα της διαδερμικής χορήγησης περιλαμβάνουν την εύκολη προσβασιμότητα του δέρματος, την τεράστια επιφάνεια εφαρμογής, την ακριβή στόχευση (μόνο τριχωτό) και τη δυνατότητα να επιτευχθεί παρατεταμένη απελευθέρωση, καθώς το δέρμα δρα ως δεξαμενή (reser- voir). Αυτά τα πλεονεκτήματα της διαδερμικής χορήγησης σε συνδυασμό με τον ολοένα αυξανόμενο ρυθμό ανακάλυψης καινοτόμων μακρομοριακών φαρμάκων, έχουν οδηγήσει σε σημαντική πρόοδο την ανάπτυξη διαδερμικών συσκευών μέσα στην τελευταία δεκαετία.
Ωστόσο, οι προκλήσεις της εισαγωγής γονιδίων στα ανθρώπινα επιδερμικά κύτταρα είναι τεράστιες, δεδομένου ότι η επιδερμίδα και η κεράτινη στοιβάδα έχουν εξελιχθεί ως φραγμοί ενάντια στην είσοδο οποιασδήποτε ουσίας ή οργανισμού, συμπεριλαμβανομένων και των ιών, στο σώμα. Η κεράτινη στοιβάδα διαπερνάται από έναν αριθμό επιδερμικών εξαρτημάτων και δεν ήταν σαφής μέχρι πρότινος ο ρόλος τους όσον αφορά τη διαδερμική απορρόφηση. Με αυτό το δεδομένο, η διείσδυση ουσιών μέσω του τριχοθυλακιακού πόρου έχει μελετηθεί εδώ και 20 χρόνια και έχει αποδειχθεί πως είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για την είσοδο ουσιών διαμέσου του δέρματος ή στο καθαυτό δέρμα.
Η γενικότερη εικόνα ήταν πως ο ρόλος των τριχοθυλακίων είναι ασήμαντος, καθότι καταλαμβάνουν <0,1% της επιφάνειας του δέρματος. Το 2011 η άποψη αυτή άλλαξε δραματικά. Αποδείχθηκε ότι τα τριχοθυλάκια αντιπροσωπεύουν σημεία στα οποία διακόπτεται ο απόλυτος φραγμός του δέρματος και μπορούν να λειτουργήσουν ως «παγίδες» για σωματίδια που δεν είναι σε θέση να διαπεράσουν το φραγμό του δέρματος μέσω της διακυτταρικής (intercellular) ή της ενδοκυτταρικής (transcel- lular) οδού διείσδυσης.
Αυτά τα αποτελέσματα εξήχθησαν κατόπιν ευφυών πειραμάτων από τους Lademann et al., κατά τα οποία φράχθηκαν επιλεκτικά τα στόμια των τριχοθυλακιακών πόρων και αποδείχθηκε πως οι τριχοθυλακιακοί πόροι αποτελούν τελικά την κύρια οδό απορρόφησης του ανθρώπινου τριχωτού (appendageal route).
Η χοάνη του τριχοθυλακίου (infundibulum) είναι μία ακόμη περιοχή ερευνητικού ενδιαφέροντος, καθώς το βαθύτερο τμήμα της αποτελεί ατελή φραγμό με αυξημένη διαπερατότητα, περιβάλλεται από ανοσοποιητικά κύτταρα σε υψηλή πυκνότητα και από ένα εκτεταμένο δίκτυο τριχοειδών. Η εγγύτητα με τα τριχοειδή αγγεία καθιστά δυνατή την ταχεία μεταφορά ουσιών στη συστηματική κυκλοφορία και η υψηλή πυκνότητα των ανοσοποιητικών κυττάρων επιτρέπει στο τριχοθυλάκιο να είναι ένας πιθανός, τοπικός στόχος για συστεμικό εμβολιασμό. Οι δύο αυτοί ρόλοι είναι δυνητικά χρήσιμοι στη Γενετική Μηχανική.
Έχει ανακαλυφθεί πλήθος συσκευών για αύξηση της διαδερμικής απορρόφησης και όλες αυτές θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη διαδερμική διείσδυση των γονιδίων στο ανθρώπινο δέρμα. Οι συσκευές αυτές μπορούν να καταταχθούν σε παθητικές ή ενεργητικές μεθόδους, ανάλογα με το αν παρέχεται μια εξωτερική πηγή ενέργειας για την ενίσχυση της διαδερμικής διείσδυσης:
#1: Οι παθητικές μέθοδοι περιλαμβάνουν τη χρήση χημικών ενισχυτικών, γαλακτωμάτων και λιπιδίων, καθώς και βιολογικών μεθόδων, όπως χρήση πεπτιδίων. Παρόλα αυτά, οι μέθοδοι αυτές δεν είναι κατάλληλες για τη μεταφορά γονιδίων μέσω του άθικτου δέρματος. Έχουν πρόσφατα ερευνηθεί διάφορα συστήματα χορήγησης plasmid DNA στην τριχοσμηγματογόνο μονάδα, συμπεριλαμβανομένων των niosomes, των μικροσφαιριδίων, των νανοσωματιδίων, των nanoemulsions, των νανομεταφορέων λιπιδίων, ενώ το polyethylenimine-DNA χρησιμοποιήθηκε με επιτυχία από τους Jan et al. (2012) για την in vitro μεταφορά ανθρώπινης telomerase reverse transcriptase σε τριχοθυλάκια.
Στις παθητικές μεθόδους ανήκουν και τα λιποσώματα (Lipoplexes), τα οποία κατέχουν ορισμένα χαρακτηριστικά που τα καθιστούν κατάλληλα ως τοπικούς μεταφορείς ουσιών: αποτελούνται από φυσικά συστατικά που ανευρίσκονται στο ανθρώπινο σώμα (λιπίδια, στερόλες), είναι βιοδιασπώμενα, μη τοξικά και μη αλλεργιογόνα. Συχνά έχουν χρησιμοποιηθεί Li- poplexes για να «επιμολύνουν» in vitro κύτταρα με plasmid DNA και πιθανόν να είναι αποτελεσματικά και in vivo. Πολλαπλές μεταβλητές επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα αυτής της επιμόλυνσης, συμπεριλαμβανομένης της αναλογίας λιποσωμάτων/DNA, της απόλυτης συγκέντρωσης των λιποσωμάτων και DNA και της σύνθεσης των λιποσωμάτων.
#2: Οι ενεργητικές μέθοδοι αυξάνουν τη μεταφορά μέσω του δέρματος με την εφαρμογή εξωτερικής δύναμης ή διασπώντας το δερματικό φραγμό και ολοένα και περισσότεροι ακαδημαϊκοί και ερευνητές ασχολούνται με συσκευές ενεργητικής διαδερμικής διείσδυσης. Αυτές οι δραστικές μέθοδοι αύξησης της απορροφητικότητας του δέρματος, όπως οι μικροβελόνες (microneedles), τα jet injectors, η ιοντοφόρηση, η ηλεκτροδιάτρηση (electroporation), η θερμική ενέργεια, οι υπέρηχοι, η ένεση στερεών (powder injection), η επεμβατική αφαίρεση της κεράτινης στοιβάδας δέρματος (abla- tion), η αφαίρεση της κεράτινης στοιβάδας με ταινία (tape stripping), τα biolistic injectors και τα gene guns θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την παράδοση των ανασυνδυασμένων γονιδίων στο δέρμα και στα τριχοθυλάκια.
Ένταξη των γονιδίων στο τριχοθυλακιακό DNA
Μόλις επιλεγεί ένα γονίδιο με βάση το θεραπευτικό του αποτέλεσμα, πρέπει να ενσωματωθεί αποτελεσματικά στο DNA του τριχοθυλακιακού βλαστοκυττάρου. Τα επίπεδα έκφρασης ενός γονιδίου μπορούν να ενισχυθούν με την αύξηση της πρόσληψης του DNA από τα κύτταρα και της μεταφοράς του στον πυρήνα.
Η τρέχουσα έρευνα στο πεδίο της targeted gene repair επικεντρώνεται στη χρήση των μονοκλωνικών ολιγονουκλεοτιδίων (single stranded oligo- nucleotides, ssODNs) για την πρόκληση γονιδιωματικών και φαινοτυπικών αλλαγών στα πειραματικά μοντέλα. Το ποσοστό επιδιόρθωσης των γονιδίων που επιτυγχάνεται με τη χρήση τροποποιημένων ssODNs είναι μεταβλητό και κυμαίνεται από <1% έως >40% στους διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων-στόχων. Αυτές οι τιμές εξαρτώνται από το συγκεκριμένο γονίδιο και τον κλώνο-στόχο, τις τροποποιήσεις ssODN, το μήκος και το είδος του κυττάρου, αλλά και τα επιμέρους πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται από τους ερευνητές.
Οι προσεγγίσεις που στοχεύουν στη σταθεροποίηση και στην αύξηση της συχνότητας της διόρθωσης περιλαμβάνουν την πρόκληση «ρηγμάτων» στο DNA (induction of DNA breaks), τις μεταβολές της διαμόρφωσης της χρωματίνης, τη χειραγώγηση του κύκλου ζωής του κυττάρου και την αναστολή πρωτεϊνών που έχουν αποδειχθεί ότι καταστέλλουν την επιδιόρθωση των γονιδίων (gene repair reaction). Πολλοί ερευνητές έχουν προσπαθήσει να δημιουργήσουν ένα θεραπευτικό σύστημα μεταφοράς γονιδίων για τα τριχοθυλάκια, χρησιμοποιώντας μεθόδους in vivo ή ex vivo:
#1: Οι in vivo προσεγγίσεις περιλαμβάνουν άμεση παράδοση γονιδίων σε άθικτο δέρμα και την ενσωμάτωση μέσω ιογενών ή μη ιογενών τεχνικών:
- Στις ιογενείς in vivo τεχνικές, το πλασμίδιο ή ο ιογενής φορέας παραδίδει το γονίδιο απευθείας στα τριχοθυλακιακά κερατινοκύτταρα. Αυτό μπορεί να γίνει με τοπική εφαρμογή lipoplexed DNA ή με ενδοδερμική ένεση φορέων. Οι ανασυνδυασμένοι ρετροϊικοί φορείς που επιτρέπουν μακροχρόνια διαγονιδιακή (transgene) έκφραση, επειδή είναι εξαιρετικά αποδοτικοί στην ενσωμάτωση των γονιδίων στο DNA του ξενιστή.
- Οι μη-ιογενείς in vivo τεχνικές περιλαμβάνουν την άμεση έγχυση του plasmid DNA ή των RNA:DNA ολιγονουκλεοτιδίων (RDO), το βομβαρδισμό σωματιδίων (particle bombardment) και την τοπική εφαρμογή γυμνού (naked) DNA. Οι μη ιογενείς in vivo τεχνικές έχει αποδειχθεί ότι έχουν μόνο παροδική έκφραση. Τα σημαντικά προβλήματα με τις in vivo μεθόδους περιλαμβάνουν την παροδική έκφραση του γονιδίου, τη χαμηλή αποτελεσματικότητα της μεταφοράς γονιδίων σε σύγκριση με τις ex vivo τεχνικές και τις πιθανές ανοσολογικές αντιδράσεις έναντι των ιογενών φορέων.
#2: Στην ex vivo προσέγγιση, τα κύτταρα απομακρύνονται αρχικά από τη φυσική τους εντόπιση, «επιμολύνονται» in vitro με έναν ιογενή φορέα και επανεισάγονται στο λήπτη. Αυτή η τεχνική έχει περισσότερες πιθανότητες να προσφέρει μακροχρόνια γονιδιακή έκφραση, διότι τα κερατινικά βλαστοκύτταρα στοχεύονται και «χειραγωγούνται» με ακρίβεια. Ωστόσο, η μέθοδος αυτή είναι περισσότερο απαιτητική τεχνικά και ανακύπτουν λειτουργικά ζητήματα κατά την επανεμφύτευση των βλαστοκυττάρων, αντίστοιχα με αυτά της «κλωνοποίησης» τριχοθυλακίων.
Τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα των ex vivo στρατηγικών περιλαμβάνουν τη δυνατότητα αύξησης του αριθμού των κυττάρων in vitro, την υψηλότερη αποτελεσματικότητα της «επιμόλυνσης» που επιτυγχάνεται in vitro, τη δυνατότητα ελέγχου των μεταλλαγμένων κυττάρων πριν από την εισαγωγή τους στο λήπτη και την αποφυγή ανοσολογικής αντίδρασης στους ιογενείς φορείς, δεδομένου ότι τα επανεισηγμένα κύτταρα δεν παράγουν ιογενείς πρωτεΐνες. Τα μειονεκτήματα περιλαμβάνουν την ανάγκη καλλιέργειας των κυττάρων, την απώλεια της αρχιτεκτονικής του ιστού, την αλλοίωση του φαινοτύπου των κυττάρων και την ανάγκη «επεμβατικής» επανεμφύτευσης, που μπορεί να οδηγήσει σε τοπική ουλοποίηση, τραυματισμό και τελικά απώλεια μαλλιών.
Προβλέψιμο αποτέλεσμα
Σε πειραματικό επίπεδο έχει επιτευχθεί η εισαγωγή γονιδίων σε τριχοθυλακιακά κύτταρα, αρχικά από τους Li et al. (1993). Έπειτα από τη δημοσίευση των Li et al., δημοσιεύτηκαν αρκετά άρθρα σχετικά με την πιθανότητα γενετικής τροποποίησης των τριχοθυλακίων in vitro και in vivo. Πιο συγκεκριμένα, οι Cotsarelis et al. απέδειξαν ότι η τοπική εφαρμογή λιποσωμάτων που περιέχουν γονίδια κατά την έναρξη του αναγενούς σταδίου ήταν καθοριστική για την επιτυχή επιμόλυνση των τριχοθυλακίων ποντικιού και ανθρώπου.
Οι Ale- xeev et al. απέδειξαν ότι ένα RNA-DNA ολιγονουκλεοτίδιο διόρθωσε ένα σημείο μετάλλαξης στο γονίδιο της τυροσινάσης στα τριχοθυλάκια ποντικιών, αποκαθιστώντας τη σύνθεση της μελανίνης in vivo, αν και με πολύ χαμηλή αποτελεσματικότητα. Οι Zhao et al. έδειξαν πως η ιστοκαλλιέργεια δέρματος albino-ποντικιού, όταν έχει επιμολυνθεί με pLme/SN ρετροϊό, παρήγαγε χρωστικές μελανίνης στους βολβούς και στα στελέχη της τρίχας, υποδηλώνοντας ότι ο φορέας του γονιδίου της τυροσινάσης μεταφέρθηκε και εκφράστηκε στα μελανοκύτταρα.
Σε μελέτη των Saito et al. εξελίχθηκε μια αποτελεσματική τεχνική για τη γενετική τροποποίηση της ανάπτυξης του στελέχους της τρίχας με τη χρήση κολλαγόνου για την ενίσχυση της μεταφοράς γονιδίων στο τριχοθυλάκιο που προκλήθηκε πιθανόν από partial di- gestion του χορίου, που εξέθεσε το θυλάκιο πληρέστερα στον GFP-αδενοϊό. Ωστόσο, κανένα από αυτά τα πειράματα δεν ήταν in vivo σε ανθρώπους, ενώ δεν έχει δημοσιευτεί -ούτε καν προγραμματιστεί- clinical trial Γενετικής Μηχανικής για οποιαδήποτε διαταραχή των τριχοθυλακίων.
Η δυνατότητα εφαρμογής στο ανθρώπινο δέρμα των μέχρι σήμερα θετικών πειραματικών αποτελεσμάτων δεν είναι βέβαιο πως θα είναι εφικτή, εξαιτίας των σημαντικών διαφορών ανάμεσα στο δέρμα και στα τριχοθυλάκια των πειραματόζωων και του ανθρώπου.
Οι κυριότερες από αυτές τις διαφορές είναι:
- Τα τριχοθυλάκια του ποντικιού έχουν συγχρονισμένους κύκλους κατά τη διάρκεια των πρώτων 2-3 μηνών της ζωής τους και, ελλείψει πολλαπλασιαστικών ερεθισμάτων, βρίσκονται κυρίως στο τελογενές στάδιο. Στο φυσιολογικό ανθρώπινο τριχωτό, το 80-90% των τριχοθυλακίων είναι στο αναγενές στάδιο, περίπου το 10% είναι στο τελογενές στάδιο και ένα μικρό ποσοστό (5-10%) είναι στην έναρξη του καταγενούς ή αναγενούς σταδίου.
- Στον άνθρωπο, η επιδερμίδα είναι παχύτερη, τα τριχοθυλάκια είναι πολύ μεγαλύτερα και τα χαρακτηριστικά των δενδριτικών επιδερμικών κυττάρων είναι διαφορετικά από αυτά των ποντικών. Συγκεκριμένα, τα ανθρώπινα τριχοθυλάκια του τριχωτού είναι πολύ μεγαλύτερα, φτάνοντας σε μήκος τα 5mm, σε σύγκριση με αυτά των ποντικών, τα οποία είναι μόλις 1mm. Τα τριχοθυλάκια vibrissae που έχουν μελετηθεί εκτενώς, είναι μεν μεγαλύτερα από τα τριχοθυλάκια του τριχώματος και συνεπώς ομοιάζουν κάπως με τα ανθρώπινα τριχοθυλάκια, αλλά είναι εξαιρετικά ασυνήθιστα ως προς τη δομή τους και τις ιδιότητες του κύκλου ζωής τους.
Μέχρις ότου να γίνουν εκτενή in vivo πειράματα σε ανθρώπους, δεν θα είμαστε βέβαιοι ποια είναι η αποτελεσματικότητα και η επαναληψιμότητα (replicability) των πειραματικών δεδομένων.
Παρατεταμένη δράση
Το 1993 και αργότερα το 1995 αποδείχτηκε από τις πρωτοποριακές εργασίες των Li και Crystal αντίστοιχα, ότι η επιλεκτική γονιδιακή θεραπεία τριχοθυλακίων σε πειραματόζωα είναι εφικτή στοχεύοντας επιλεκτικά στα matrix κύτταρα του τριχοθυλακίου με lac-Z reporter γονίδια μέσα σε λιποσώματα. Σε μεταγενέστερα πειράματα, χρησιμοποιώντας ανθρώπινο δέρμα μεταμοσχευμένο σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια, το αναγενές τριχοθυλάκιο κατέληξε να είναι ο κύριος στόχος για τη μεταγωγή γονιδίων (gene transduction).
Αυτά τα αποτελέσματα έθεσαν τις βάσεις για τη μελέτη των Alexeev et al., κατά την οποία ένα χιμαιρικό ολιγονουκλεοτίδιο χρησιμοποιήθηκε για να διορθώσει την albino point mutation στο γονίδιο της τυροσινάσης σε ποντίκια. Η διόρθωση αποκατέστησε με κληρονομούμενο τρόπο τη δραστηριότητα της Τυροσινάσης και την ακόλουθη σύνθεση της μελανίνης και είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή χρωματισμένων τριχών στα πρωτύτερα albino ποντίκια. Η τοπική διόρθωση του γονιδίου διατηρήθηκε για τρεις μήνες, υποδηλώνοντας ότι είχαν μετατραπεί οριστικά οι πρόδρομες ουσίες των μελανοκυττάρων. Η ίδια ερευνητική ομάδα είχε προηγουμένως δημοσιεύσει μία in vitro μελέτη, που απέδειξε πως το ίδιο χιμαιρικό ολιγονουκλεοτίδιο διόρθωσε την albino μετάλλαξη σε καλλιέργειες μελανοκυττάρων, έχοντας ξανά ως αποτέλεσμα κληρονομούμενη παραγωγή μελανίνης.
Σε in vivo μελέτη των Hoffman et al., το ίδιο χιμαιρικό ολιγονουκλεοτίδιο χορηγήθηκε με λιποσώματα και με ενδοδερμική ένεση σε πειραματόζωα. Όταν το προσδιορισμένο με fluorescent χιμαιρικό ολιγονουκλεοτίδιο εφαρμόστηκε τοπικά μέσα σε σκεύασμα λιποσωμάτων, ανιχνεύθηκε fluorescent χρωστική κυρίως στα τριχοθυλάκια και στην επιδερμίδα. Η ενδοδερμική ένεση οδήγησε σε πιο αποτελεσματική, αλλά λιγότερο στοχευμένη παράδοση και εντοπίστηκε fluorescent χρωστική στο δέρμα, καθώς και στα τριχοθυλάκια. Από αυτά τα πειραματικά δεδομένα φαίνεται πως η παρατεταμένη δράση είναι εφικτή στα πειραματόζωα και πιθανόν να είναι δυνατή και στα ανθρώπινα τριχοθυλάκια.
Βραχυχρόνια και μακροχρόνια ασφάλεια
Προκειμένου το αποτέλεσμα μιας γονιδιακής θεραπείας να χαρακτηριστεί αξιόλογο, θα πρέπει εκτός από προβλέψιμο να είναι απαραιτήτως και ασφαλές, βραχυπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα. Η τοπική εφαρμογή λιποσωμάτων για τη στοχοποίηση των τριχοθυλακίων έχει αποδειχθεί από τις αρχικές μελέτες των Li et al. πως είναι ασφαλής διαδικασία. Μεταγενέστερη μελέτη από τους Domashenko et al. έδειξε πώς η πρόσληψη γονιδίων έπειτα από την τοπική χορήγηση μείγματος λιποσωμάτων-DNA σε δερματικά xenografts πειραματόζωων θα μπορούσε να βελτιστοποιηθεί με την κατάλληλη σύνθεση των λιποσωμάτων και την προετοιμασία του δέρματος με αποτρίχωση και χρήση ρετινοϊκού οξέος, προκειμένου να αυξηθεί ο αριθμός των αναγενών τριχοθυλακίων.
Στο συγκεκριμένο πείραμα βρέθηκαν «επιμολυσμένα» κύτταρα μόνο στα τριχοθυλάκια που ήταν στο πρώιμο αναγενές στάδιο, ενώ δεν «επιμολύνθηκαν» τριχοθυλάκια στο τελογενές, το καταγενές, ή στο κυρίως αναγενές στάδιο. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης όταν εφαρμόστηκε αποτρίχωση και ρετινοϊκό οξύ ήταν 10±6% του συνολικού αριθμού των τριχοθυλακίων μέσα στο xe- nograft. Οι Sato et al. χρησιμοποίησαν ενδοδερμική ένεση για την εισαγωγή πλασμιδιακού DNA ή φορέων ιών στο θηλώδες χόριο τριχώματος ποντικιών.
Χρησιμοποιήθηκε φορέας αδενοϊού για τη μεταφορά DNA στο δέρμα νεογέννητων ποντικών. Σε ποντίκια που έλαβαν ενδοδερμική ένεση, προκλήθηκε ταχεία είσοδος στο αναγενές στάδιο, αύξηση του μεγέθους των τριχοθυλακίων και παραγωγή μελανίνης. Οι ερευνητές κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η παροδική, εντοπισμένη υπερέκφραση της SHh στο δέρμα προάγει την είσοδο στο αναγενές στάδιο και ως εκ τούτου ενεργεί παρόμοια με «βιολογικό διακόπτη». Επιπλέον, στους έξι μήνες μετά την ένεση SHh, παρέμενε φυσιολογική η ιστολογική εικόνα του δέρματος και δεν υπήρχαν ενδείξεις παθολογικών ανωμαλιών, όπως εκείνες που συνδέονται με τη δομική υπερέκφραση της SHh κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης (π.χ. τριχοθυλακιακοί όγκοι και βασικοκυτταρικό καρκίνωμα).
Εντούτοις, η επιτυχία των παραπάνω πειραμάτων Γενετικής Μηχανικής δεν εξασφαλίζει πως η εφαρμογή της Γενετικής Μηχανικής στον άνθρωπο είναι άμοιρη επιπλοκών και η λανθασμένη εφαρμογή της έχει οδηγήσει ακόμα και σε απώλειες ανθρώπινων ζωών.
Ένας από τους βασικούς κινδύνους-επιπλοκές της Γενετικής Μηχανικής είναι η ενσωμάτωση του γονιδίου να είναι λανθασμένη και να προκαλέσει επιβλαβείς μεταλλάξεις έως και πλήρη καρκινική εκδήλωση. Επίσης, οι ιικοί φορείς που χρησιμοποιούνται για τη μεταφορά και ενσωμάτωση γονιδίων πιθανόν να μπορούν να επιμολύνουν με την αρχική ιογενή τους ιδιότητα τα υγιή κύτταρα, με απρόβλεπτες συνέπειες.
Ένας επιπλέον κίνδυνος είναι τα μεταφερόμενα γονίδια να επιμολύνουν αναπαραγωγικά κύτταρα του ασθενούς και στο μέλλον να υπάρξει μετάδοση του γονιδίου σε απογόνους. Τέλος, άλλες σημαντικές επιφυλάξεις των ερευνητών είναι η πιθανότητα υπερέκφρασης του γονιδίου, με βλαβερές συνέπειες για τον ξενιστή, η μετάδοση του ιικού φορέα από τον ξενιστή στην κοινότητα και η πρόκληση αυτοάνοσων νοσημάτων στον ξενιστή, ως αντίδραση στην είσοδο του ιού-φορέα ή του γονιδίου στον οργανισμό. Η τελευταία αυτή επιπλοκή έχει μέχρι σήμερα κοστίσει τη ζωή της εφήβου Jesse Gelsinger και της Jolee Mohr, δύο εθελοντών σε κλινικές δοκιμές Γενετικής Μηχανικής, ενώ έχει αναφερθεί και η πρόκληση λευχαιμίας σε τρία παιδιά που έπασχαν από τη σπάνια ασθένεια X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) και αντιμετωπίστηκαν με πειραματική γονιδιακή θεραπεία.
Δυστυχώς, μέχρι σήμερα ουσιαστικά ασφαλείς θεραπείες δεν έχουν προκύψει από τη γονιδιακή μηχανική και πλέον η οδηγία του FDA είναι πως η Γενετική Μηχανική πρέπει να αποτελεί ύστατη εναλλακτική, έπειτα από αποτυχία οποιασδήποτε άλλης μεθόδου και μόνο προκειμένου να αντιμετωπιστούν βαριές και δυνητικά θανατηφόρες νόσοι.
Συμπεράσματα
Παρά τα επιστημονικά ερωτήματα και τα ηθικά διλήμματα που προκύπτουν από την εφαρμογή της γονιδιακής θεραπείας, το πεδίο θα εξακολουθήσει να αναπτύσσεται και υπάρχει η βάσιμη διαίσθηση ότι θα αλλάξει την Ιατρική πιο ριζικά από οποιοδήποτε προηγούμενο ιατρικό επίτευγμα, με την προϋπόθεση φυσικά πως θα εξασφαλιστεί η ασφάλεια των ασθενών και θα τηρούνται οι δεοντολογικές απαιτήσεις.
Τα ζητήματα ασφάλειας των πειραμάτων Γενετικής Μηχανικής είναι μάλιστα η αιτία που ο αρχικός ενθουσιασμός για προγραμματισμό και έγκριση μελετών έχει …καταλαγιάσει από το 2009 και πλέον ολοένα και λιγότερες κλινικές δοκιμές Γενετικής Μηχανικής προγραμματίζονται και εγκρίνονται. Επίσης, το σύνολο της γονιδιακής έρευνας που λαμβάνει την απαραίτητη κρατική χρηματοδότηση εντοπίζεται μόνο σε σοβαρές, θανατηφόρες ασθένειες και σε σπάνιες μονογονιδιακές νόσους, για τις οποίες δεν είναι οικονομικά συμφέρον να εξελιχθούν νέες φαρμακευτικές αγωγές. (orphan drugs). Δεν υπάρχει καμία πρόβλεψη για χρηματοδότηση έρευνας Γενετικής Μηχανικής για οποιαδήποτε νόσο των τριχοθυλακίων από κρατικό ίδρυμα ή ιδιωτική εταιρεία, παγκοσμίως.
ΣΥΝΟΨΗ
Η επονομαζόμενη γονιδιακή θεραπεία (Γενετική Μηχανική) δεν αποτελεί ακόμα καν θεραπεία: δεν συνταγογραφείται πουθενά στον κόσμο και είναι διαθέσιμη αυστηρά και μόνο στα πλαίσια κλινικών δοκιμών. Σε θεωρητικό επίπεδο, η Γενετική Μηχανική έχει ενδιαφέρουσες προοπτικές αλλά στην πραγματικότητα η μαζική, κλινική εφαρμογή της αποτελεί σενάριο επιστημονικής φαντασίας, τουλάχιστον με τις παρούσες γνώσεις και δυνατότητές μας στο συγκεκριμένο πεδίο.
Οι διαταραχές των τριχοθυλακίων και κυρίως η ΑΑ θα ωφεληθούν από τη γονιδιακή θεραπεία μόνον αν υπάρξει κάποιο τυχαίο εύρημα κατά την έρευνα κάποιας άλλης, σοβαρής/θανατηφόρας νόσου, που θα μπορέσει να βρει εφαρμογή στην αντιμετώπιση της ΑΑ. Εντούτοις, μέχρις ότου να επιβεβαιωθεί η μακροχρόνια αποτελεσματικότητα και η ασφάλεια, είναι βέβαιο πως θα περάσουν δεκαετίες.
